免费国产高清在线观看最新-俩小伙探花专约老熟女-大鸡巴插大嫩骚逼好紧视频-国产不卡一区二区在线视频

細(xì)胞系在生物科學(xué)中被廣泛使用，它們無(wú)限增殖的能力意味著，從理論上講，科學(xué)家們可以精確地復(fù)制以前的研究重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果或者在此結(jié)果基礎(chǔ)上做更深入的研究。但是細(xì)胞系被貼錯(cuò)標(biāo)簽或處理不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致有問(wèn)題的細(xì)胞系的錯(cuò)誤識(shí)別，污染和/或傳播，進(jìn)而可能影響研究數(shù)據(jù)的有效性和準(zhǔn)確性。

科學(xué)研究中所用細(xì)胞系的真實(shí)性驗(yàn)證是基礎(chǔ)而且必要的。真實(shí)性驗(yàn)證能夠確保細(xì)胞沒(méi)有鑒定錯(cuò)誤、沒(méi)有交叉污染、遺傳上與起始保存樣品沒(méi)有差異。那在科學(xué)研究工作中應(yīng)該如何選擇所需要的細(xì)胞？如何獲取實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞？所選用的或得到的細(xì)胞可靠性如何？如何判斷？這些問(wèn)題對(duì)于需要使用細(xì)胞進(jìn)行研究工作的科研人員是必須首先解決的問(wèn)題。希望大家能在接下來(lái)的內(nèi)容中找到答案。

一、細(xì)胞來(lái)源
細(xì)胞系可以 1) 直接從各種正常組織直接取材，進(jìn)行原代培養(yǎng)，2) 可以從其他實(shí)驗(yàn)室獲得，3) 也可以從細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)。無(wú)論采用何種來(lái)源，都必須確保對(duì)細(xì)胞進(jìn)行身份驗(yàn)證，并且沒(méi)有污染，例如支原體。那不同來(lái)源的細(xì)胞需要注意哪些問(wèn)題呢？
1、直接取材，進(jìn)行原代培養(yǎng)獲得
從新鮮組織中衍生出一種新的細(xì)胞系，特別是人類(lèi)細(xì)胞，是一項(xiàng)昂貴且費(fèi)時(shí)的工作。新細(xì)胞系的后續(xù)價(jià)值將取決于驗(yàn)證其來(lái)源的能力以及相關(guān)的可用信息。這些信息包括細(xì)胞來(lái)源組織，臨床資料，其他相關(guān)信息。
（1）細(xì)胞來(lái)源組織：首先需要獲得捐助者或患者的同意和/或道德審查許可。另外，要記錄組織來(lái)源，進(jìn)行組織病理學(xué)驗(yàn)證，與正常組織進(jìn)行比較。
（a）將用于原代培養(yǎng)的一小部分樣品（或血液樣品或來(lái)自供體的 DNA）立即冷凍或處理。然后可以使用組織或 DNA 明確證明該細(xì)胞系源自推定的供體。盡管基因型（核型，拷貝數(shù)變異（CNV）作圖分析，甚至全基因組序列）的其他信息有時(shí)會(huì)有助于確保身份，但建議采用短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）進(jìn)行身份驗(yàn)證。
（b）理想的情況是，用于組織病理學(xué)驗(yàn)證的組織最好由同一組織病理學(xué)家報(bào)告手術(shù)標(biāo)本。如果患者樣本由臨床醫(yī)生直接提供給實(shí)驗(yàn)室，則此步驟特別重要，因?yàn)樗赡軣o(wú)法代表發(fā)送給組織病理學(xué)家的手術(shù)樣本。例如，它可能距腫瘤一定距離并因此缺乏癌細(xì)胞，或者可能來(lái)自不受遺傳或表觀遺傳缺陷引起的特定病理學(xué)影響的區(qū)域。
（c）少量血液（例如 10 毫升）或正常組織應(yīng)冷凍。該組織以后可用于尋找遺傳差異，也可用于身份驗(yàn)證。對(duì)于 iPSC 品系，或當(dāng)使用直接重編程從一種衍生出另一種體細(xì)胞類(lèi)型時(shí)，冷凍保存所用原始細(xì)胞的儲(chǔ)備液也是一種好習(xí)慣。這些對(duì)于使用新的重編程技術(shù)衍生出其他細(xì)胞系可能很重要，而且對(duì)于提供原始供體材料以驗(yàn)證使用該細(xì)胞系的后來(lái)發(fā)現(xiàn)也可能很重要。如果使用體細(xì)胞核移植（SCNT）或「克隆」技術(shù)來(lái)衍生細(xì)胞系，例如 ES 細(xì)胞，則應(yīng)分別保留來(lái)自體細(xì)胞供體和卵母細(xì)胞供體的細(xì)胞或組織，以匹配核和線粒體 DNA。

（2）臨床資料：如果捐贈(zèng)者或患者表示同意并經(jīng)過(guò)道德審查，則應(yīng)盡可能多地記錄和存儲(chǔ)以下盡可能多的信息。用于明確識(shí)別捐贈(zèng)者的信息（包括姓名，醫(yī)院編號(hào)，地址和出生日期）應(yīng)以更高的安全性存儲(chǔ)，最好與其他數(shù)據(jù)分開(kāi)存儲(chǔ)。在英國(guó)，需要 NHS 合同或名譽(yù)合同來(lái)獲得患者詳細(xì)信息，并且此類(lèi)信息切勿與未經(jīng)授權(quán)的同事共享或發(fā)布到公共領(lǐng)域。
（a）供體/患者的年齡和性別
（b）醫(yī)院和病理編號(hào)
（c）組織標(biāo)本的起源部位和性質(zhì)
（d）癌癥或其他綜合癥或病理的階段和等級(jí)
（e）組織病理學(xué)報(bào)告的副本
（f）臨床病史包括治療
（g）其他信息，例如腫瘤標(biāo)記物狀態(tài)，遺傳信息和家庭數(shù)據(jù)等
（h）捐助者的知情同意和放棄商業(yè)權(quán)利的證據(jù)

（3）其他相關(guān)信息：關(guān)于該細(xì)胞系的起源和派生保留的信息越多，該細(xì)胞系對(duì)始發(fā)者和任何后續(xù)用戶有用的可能性就越大。這些信息包括：所有培養(yǎng)基和添加劑的類(lèi)型，來(lái)源和批號(hào)以及建立細(xì)胞系的方法；使用抗生素情況，支原體檢測(cè)情況；細(xì)胞系是否經(jīng)過(guò)基因修飾；對(duì)于 iPSC 或通過(guò)直接重編程衍生的細(xì)胞系，應(yīng)描述所用方法，包括所用基因和載體等等。

2、從其他實(shí)驗(yàn)室獲得
從其他實(shí)驗(yàn)獲得細(xì)胞這種途徑存在許多潛在的危害。細(xì)胞系可能根本不是他們聲稱(chēng)的那樣，并且不能保證它仍然是同一細(xì)胞系或具有與已發(fā)布描述的相同屬性。如果接收實(shí)驗(yàn)室希望依靠通過(guò)細(xì)胞系獲得的歷史數(shù)據(jù)，則在接受進(jìn)入的細(xì)胞系用于一般用途之前，應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。
在收到細(xì)胞細(xì)后，同時(shí)在在凍存之前，應(yīng)使用已經(jīng)批準(zhǔn)的基于 DNA 的方法進(jìn)行細(xì)胞系鑒定，以確認(rèn)細(xì)胞系的起源并檢查錯(cuò)誤識(shí)別。對(duì)照國(guó)際細(xì)胞系認(rèn)證委員會(huì)（ICLAC）錯(cuò)誤識(shí)別的細(xì)胞系數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)檢查細(xì)胞系名稱(chēng)。在將新的細(xì)胞系存入液氮時(shí)應(yīng)重新用 STR 對(duì)細(xì)胞身份進(jìn)行驗(yàn)證。人類(lèi)細(xì)胞系可能攜帶病原體，包括病毒污染，對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員構(gòu)成潛在的健康危害。它們還可能被細(xì)菌，真菌，支原體或病毒污染，并可能擴(kuò)散到其他細(xì)胞系。如果要將這些細(xì)胞用于動(dòng)物，必須對(duì)它們進(jìn)行測(cè)試并證明不含相關(guān)病原體，這一點(diǎn)也很重要。否則這些病原體可能會(huì)對(duì)動(dòng)物或者照顧動(dòng)物的科研人員帶來(lái)危害。
新細(xì)胞系應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室和儲(chǔ)存中進(jìn)行隔離，直到對(duì)它們的來(lái)源進(jìn)行鑒定，并證明它們不含微生物。最佳方法是擁有 II 級(jí)微生物安全柜（MSC）和專(zhuān)用于隔離區(qū)的培養(yǎng)箱。如果無(wú)法做到這一點(diǎn)，則應(yīng)采取其他步驟以zui大程度地減少污染擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，其中包括（a）僅當(dāng)當(dāng)天所有其他細(xì)胞培養(yǎng)完成后才對(duì)新細(xì)胞系進(jìn)行處理，（b）在進(jìn)入普通培養(yǎng)箱之前，應(yīng)應(yīng)將新的培養(yǎng)物放置在專(zhuān)用培養(yǎng)箱中或密封容器中；（c）使用后，應(yīng)使用合適的非腐蝕性消毒劑清潔 MSC，并在關(guān)閉前再運(yùn)行至少 5 分鐘。
用戶還應(yīng)確認(rèn)他們獲得的細(xì)胞系適合于他們自己的特定目的。即使顯示出細(xì)胞系是真實(shí)的，它也可能會(huì)隨著傳代時(shí)間的延長(zhǎng)而失去特定的關(guān)鍵特征。 核型分析是一種簡(jiǎn)單的測(cè)試，可以揭示細(xì)胞系的變化。在開(kāi)始工作之前確認(rèn)適當(dāng)?shù)奶匦钥梢怨?jié)省大量的時(shí)間和精力。

3、從細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)
學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)或商業(yè)機(jī)構(gòu)已經(jīng)建立了許多保藏中心或細(xì)胞庫(kù)。這些來(lái)源的細(xì)胞系已經(jīng)進(jìn)行了驗(yàn)證，并鑒定其在培養(yǎng)物中常見(jiàn)的污染微生物，因此除非隨附信息中另有說(shuō)明，否則它們不太可能被污染或錯(cuò)誤識(shí)別。但是，其中一些細(xì)胞系是在實(shí)驗(yàn)室之間多次轉(zhuǎn)移后獲得的，因此，除非在分析證書(shū)中明確說(shuō)明，否則不能保證真實(shí)性和不受微生物污染的影響。這些保藏中心或者細(xì)胞庫(kù)會(huì)對(duì)其細(xì)胞系進(jìn)行常規(guī)驗(yàn)證，并為細(xì)胞系提供分析證書(shū)，包括 STR 分型報(bào)告。

二、細(xì)胞儲(chǔ)存

一旦細(xì)胞系已經(jīng)開(kāi)發(fā)或獲得并驗(yàn)證（即顯示為真實(shí)且未受污染），確保可靠且可重現(xiàn)的細(xì)胞供應(yīng)的第一步是冷凍保存約 20 個(gè) 1 ml 安瓿瓶，每個(gè)安瓿瓶中裝有 1~5*10^6 個(gè)細(xì)胞。這將為絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室提供多年的現(xiàn)成貨源。通常是在防腐劑（通常是含有 10％DMSO 的生長(zhǎng)培養(yǎng)基）中緩慢（通常 1 ℃ min-1）冷凍樣品來(lái)保存細(xì)胞系。某些細(xì)胞類(lèi)型，例如 hESC，可能需要超速冷凍或玻璃化，其中水被原位冷凍形成玻璃，并且不允許像慢速冷凍一樣從細(xì)胞中滲透出來(lái)，通常用于冷凍干細(xì)胞。每次冷凍一批細(xì)胞時(shí)，建議立即復(fù)蘇一個(gè)小瓶以檢查其生存能力。從庫(kù)中取出的小瓶應(yīng)快速融化（通過(guò)浸入 37°C 的水浴中），并用預(yù)熱的培養(yǎng)基逐漸稀釋細(xì)胞懸液。必須將可能具有傳染性的材料存儲(chǔ)在氣相液氮中，以減少污染性生物轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。安全起見(jiàn)，重要的物料（例如 MCB）可以分開(kāi)儲(chǔ)存到一個(gè)以上的儲(chǔ)存容器中，最好在放置到不同的位置，做好使用的登記記錄。細(xì)胞的位置應(yīng)在電子表格或數(shù)據(jù)庫(kù)中詳細(xì)說(shuō)明，并與細(xì)胞系的起源和特征以及已應(yīng)用的質(zhì)量控制措施的詳細(xì)信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)。冷凍儲(chǔ)藏容器應(yīng)裝有警報(bào)器，并定期檢查儲(chǔ)存溫度。建議每周至少一次記錄儲(chǔ)存容器中液氮的水平。對(duì)定期維護(hù)，監(jiān)視和庫(kù)存控制的證據(jù)進(jìn)行定期審核還將有助于確保存儲(chǔ)設(shè)施的安全性。

三、細(xì)胞錯(cuò)誤識(shí)別
錯(cuò)誤識(shí)別是由于交叉污染，控制不當(dāng)或文書(shū)錯(cuò)誤造成的，并暗示了良好的細(xì)胞培養(yǎng)方法（GCCP）的失敗；例如，將細(xì)胞意外轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基的儲(chǔ)液瓶中，該儲(chǔ)液瓶在 MSC 中同時(shí)具有兩個(gè)細(xì)胞系，貼錯(cuò)了燒瓶或安瓿的標(biāo)簽，或解凍了錯(cuò)誤的安瓿。交叉污染的其他來(lái)源是飼養(yǎng)細(xì)胞（例如，在 ES 細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)常使用的）由于輻照或 siliemeisuC 處理不充分仍具有有絲分裂活性，或者是制備的條件培養(yǎng)基且未進(jìn)行充分過(guò)濾以除去細(xì)胞。每當(dāng)在實(shí)驗(yàn)室中維持快速生長(zhǎng)的連續(xù)細(xì)胞系時(shí)，就有可能交叉污染（即替換）其他生長(zhǎng)較慢的細(xì)胞系的風(fēng)險(xiǎn)。我們可以從 ICLAC（ICLAC，2013a）獲得已知的錯(cuò)誤識(shí)別的細(xì)胞系列表。但是，即使某個(gè)細(xì)胞系不在該列表中，實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)始終進(jìn)行測(cè)試以確保其自身的該細(xì)胞系庫(kù)存是真實(shí)的。因此，必須采取簡(jiǎn)單的預(yù)防措施以zui大程度地減少細(xì)胞錯(cuò)誤識(shí)別的可能性，這些措施包括：
（1）所有培養(yǎng)容器以及存儲(chǔ)容器都必須小心且正確地貼上標(biāo)簽（包括細(xì)胞系的全名，傳代號(hào)和轉(zhuǎn)移日期）；
（2）生物安全柜一次只能使用一個(gè)細(xì)胞系。 取出細(xì)胞后，應(yīng)在安全柜中用適當(dāng)?shù)囊后w消毒劑擦拭并運(yùn)行至少 5 分鐘，然后再引入另一個(gè)細(xì)胞系；
（3）瓶或等分試樣只能用于一個(gè)細(xì)胞系；
（4）氣溶膠的形成必須控制在最小程度；
（5）應(yīng)定期返還冷凍存量（除非必要，否則切勿細(xì)胞系連續(xù)培養(yǎng) 43 個(gè)月或 10 代）

四、細(xì)胞的真實(shí)性驗(yàn)證
不管原代培養(yǎng)還是引進(jìn)，細(xì)胞使用時(shí)仍需進(jìn)行適當(dāng)鑒定。培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定主要有 6 個(gè)方面的要求：
1 證實(shí)其來(lái)源的物種
通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)進(jìn)行染色體檢測(cè)，進(jìn)行細(xì)胞同工酶種類(lèi)的檢測(cè)，一方面確認(rèn)其起源物質(zhì)，另一方面排除與其他種屬來(lái)源細(xì)胞的交叉污染。
2 與來(lái)源組織的關(guān)系
通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR、Western Blot 等方法，檢測(cè)細(xì)胞中特定分子的表達(dá)，確定細(xì)胞所在組織中的細(xì)胞類(lèi)型；確定細(xì)胞所處的分化發(fā)育過(guò)程中的位置（例如, 干細(xì)胞階段、前體細(xì)胞階段或分化階段）。
3 確定細(xì)胞系是否轉(zhuǎn)化
通過(guò)體內(nèi)移植，成瘤性觀察實(shí)驗(yàn)，明確該細(xì)胞系是有限細(xì)胞系還是連續(xù)細(xì)胞系；細(xì)胞系是否表達(dá)惡性特征。
4 確定無(wú)細(xì)胞系交叉污染
通過(guò)細(xì)胞 DNA 分型（指紋、SSP、STR、SNP）分析，與細(xì)胞培養(yǎng)初代和同一來(lái)源組織、血液細(xì)胞 DNA 型進(jìn)行比較，確認(rèn)細(xì)胞系無(wú)交叉污染。也可通過(guò)同工酶檢測(cè)及細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)。
5 是否有跡象表明細(xì)胞系有遺傳不穩(wěn)定的傾向性，易于轉(zhuǎn)化和表型的多樣性
通過(guò)染色體分析或 FISH 等檢測(cè)進(jìn)行觀察和證明。
6 特定細(xì)胞系需要特征的證明
一組起源相同的細(xì)胞中的特定細(xì)胞系，挑選出的細(xì)胞株或雜交細(xì)胞系，需要提供該細(xì)胞系或細(xì)胞株特征的證明，如分子標(biāo)記特征。

具體到每株細(xì)胞系，并不是所有的指標(biāo)都進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。STR 分型分析是鑒定細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)方法。美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)（ASN-0002 2011）提供了有關(guān)如何使用 STR 分析進(jìn)行人類(lèi)細(xì)胞系認(rèn)證的信息。應(yīng)遵循該標(biāo)準(zhǔn)的建議，包括使用至少八個(gè)核心 STR 基因座和應(yīng)用匹配標(biāo)準(zhǔn)（匹配閾值 80％），以允許某些細(xì)胞系中發(fā)生少量遺傳漂移。

五、支原體污染
1950 年代shou次注意到細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染，但令人遺憾的是仍然經(jīng)常忽略它的存在。我們要清楚的知道如下幾點(diǎn)，對(duì)于我們?cè)谄匠?shí)驗(yàn)中重視支原體污染問(wèn)題非常重要。
（1）在世界范圍內(nèi)，支原體污染非常頻繁。
（2）使用有支原體污染的細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤，誤導(dǎo)或錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
（3）由于缺乏明顯的體征，支原體陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)可能不被注意。
（4）注意支原體污染的潛在來(lái)源
（5）使用良好的無(wú)菌技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程，避免支原體污染。
（6）對(duì)所有未經(jīng)測(cè)試的細(xì)胞系采取有效的隔離程序。
（7）建立定期和連續(xù)的支原體檢測(cè)程序。
（8）科學(xué)期刊開(kāi)始接受支原體檢測(cè)的證據(jù)，然后再接受論文發(fā)表。
支原體污染對(duì)宿主真核細(xì)胞的影響程度變化很大，但已顯示出它可以改變?cè)S多宿主細(xì)胞的功能，包括生長(zhǎng)，形態(tài)，代謝，基因組和抗原性。因此，在實(shí)驗(yàn)中使用被支原體污染的培養(yǎng)物將引來(lái)對(duì)所產(chǎn)生的任何研究數(shù)據(jù)的有效性和重要性的明顯質(zhì)疑，并可能導(dǎo)致發(fā)表錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?，F(xiàn)在越來(lái)越多的期刊在接受論文發(fā)表前要求提供證據(jù)證明研究中已使用細(xì)胞培養(yǎng)物不存在支原體的污染。

六、總結(jié)

1、啟動(dòng)新的細(xì)胞系時(shí)，請(qǐng)記錄與組織起源有關(guān)的所有數(shù)據(jù)，并保留組織用于 DNA 分析。

2、確保新細(xì)胞系的名稱(chēng)是唯yi的。

3、獲得的細(xì)胞系應(yīng)來(lái)自可靠的來(lái)源，并且必須經(jīng)過(guò)身份驗(yàn)證以避免錯(cuò)誤識(shí)別。

4、應(yīng)當(dāng)將經(jīng)過(guò)身份驗(yàn)證的細(xì)胞保存起來(lái)，以備將來(lái)使用，并定期從冷凍庫(kù)中更換培養(yǎng)物。

5、獲取細(xì)胞系組織有道德和法律上的要求。使用人體組織樣品通常需要患者同意，并且必須定義所有權(quán)。

6、將人體組織樣本作為可能具有傳染性的材料處理。

7、在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，為所有類(lèi)型的實(shí)驗(yàn)室廢物建立正確的處置途徑，確保工作人員接受適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)。

8、從信譽(yù)良好的來(lái)源購(gòu)買(mǎi)培養(yǎng)基和試劑（尤其是血清）。

9、記錄實(shí)驗(yàn)所用的所有試劑和介質(zhì)的批號(hào)。

10、建立「標(biāo)準(zhǔn)操作程序」（SOP）。良好的細(xì)胞操作規(guī)范可以很大程度上避免其他污染。

11、確保實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的所有物品（柜，培養(yǎng)箱，高壓滅菌器，水過(guò)濾裝置等）均得到適當(dāng)維修，并在規(guī)定的范圍內(nèi)工作。

12、錯(cuò)誤識(shí)別仍然是一個(gè)主要問(wèn)題，因此所有細(xì)胞系均應(yīng)從可靠來(lái)源獲得并證明是真實(shí)的。

13、支原體的污染仍然很普遍，需要良好的組織培養(yǎng)實(shí)踐和頻繁的測(cè)試以確保細(xì)胞系清除污染。

迄今為止，只有少數(shù)的研究實(shí)驗(yàn)室和科學(xué)期刊采取措施來(lái)改變繼續(xù)使用錯(cuò)誤標(biāo)識(shí)的細(xì)胞系的可怕局面，承擔(dān)著發(fā)布高質(zhì)量受控?cái)?shù)據(jù)的責(zé)任。毋庸置疑，期刊和科學(xué)協(xié)會(huì)的企業(yè)將極大地促進(jìn)此類(lèi)質(zhì)量控制措施并加速其廣泛接受。讓我們大家共同努力，從你我做起，保證所發(fā)表的文章數(shù)據(jù)真實(shí)可信，可被重復(fù)。